肿瘤靶向治疗的新探: 多靶点Raf激酶抑制剂

陆嘉德、郭晔

转载自《中国癌症杂志》２００７年第１期

1  Raf激酶抑制剂的作用机理   

　　　目前已知，所有真核细胞中均存在Raf/MEK/ERK这一转导通路，其通过Ras、Raf、MEK及ERK的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内^[4]。许多肿瘤细胞存在这一通路的上调，而Raf为该通路中的一个关键激酶，可通过依赖或不依赖Ras的方式发挥其信号转导调节作用。作为Raf激酶的下游底物，激活的MEK磷酸化ERK，而ERK通过作用多种底物以调节细胞功能。一旦该通路发生过度激活，细胞增殖的加速与细胞生存期的延长可导致肿瘤的形成及发展。

临床前研究发现，包括VEGF、PDGF-β、表皮生长因子（EGF）及转化生长因子-α（TGF-α）等多种生长因子一旦与其同源受体结合以后，即可通过受体酪氨酸激酶自体磷酸化的方式激活Raf/MEK/ERK通路^[5]。此外，作为该通路的上游基因，ras基因在多种肿瘤中发生突变，或可直接参与Raf/MEK/ERK通路的激活过程^[6]。

Raf激酶的3个同工酶包括A-Raf、B-Raf与C-Raf（Raf-1），与细胞增殖、分化、生存、附着及血管生成的调节密切相关^[7]。其中，C-Raf在大多数人体组织中表达，且具不通过Raf/MEK/ERK通路即可调节细胞的功能^[8]。虽然C-Raf对细胞的具体调节机制目前尚未完全明朗，但很可能通过调节细胞凋亡的相关因子以抑制细胞凋亡，从而延长细胞的生存期。该机制在肿瘤形成及发展中具重要意义^[9-11]。迄今已发现Raf激酶在多种肿瘤中存在异常激活，并主要涉及B-Raf与 C-Raf： B-raf主要在恶性黑色素瘤与乳头状甲状腺癌中突变或过度表达；C-Raf主要在富血管的实体肿瘤，如肾癌、肝细胞癌以及非小细胞肺癌中异常激活。

除了可能参与肿瘤形成外，B-Raf同C-Raf与新生血管的生成也密切相关。动物实验发现，缺乏B-Raf与C-Raf基因的小鼠会在胚胎期间死于血管形成障碍^[4,12]。此外，血管生长因子如VEGF与基本纤维母细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）均可通过对于C-Raf的磷酸化来抑制血管内皮细胞的凋亡，前者需要MEK/ERK通路的参与，而后者则为直接作用^[13]。

    肿瘤转移与Raf激酶的相关性可能归因于ras基因的参与。目前已知50%的转移性肿瘤存在ras基因的突变，进而通过Raf/MEK/ERK通路发挥作用。动物研究结果显示，转染了突变ras基因的肿瘤细胞较易发生转移，该过程伴有C-Raf的激活，而含正常ras基因的肿瘤细胞则无此现象^[14]。针对恶性黑色素瘤和乳头状甲状腺癌的研究同样发现，B-Raf的激活与肿瘤的高转移性相关^{[15, 16]}。

众所周知，多药耐药基因（MDR-1）的上调及抗凋亡能力的增强是肿瘤细胞对传统细胞毒药物发生耐药的两大机制。现有资料已证实，C-Raf的激活可导致上述两种情况的出现^{[17, 18]}。

    综上所述，Raf激酶不但参与了肿瘤的形成及发展，且与肿瘤新生血管的生成密切相关，因此，对Raf激酶进行抑制可能成为靶向治疗的有效途径之一。此外，Raf激酶与肿瘤细胞对化疗产生耐药机制间可能存在的关联，也为Raf激酶抑制剂与传统化疗的联合应用提供了理论依据。

2  多靶点Raf激酶抑制剂——索拉非尼

2.1  索拉非尼治疗肾癌    

　　　透明细胞癌（clear cell carcinoma）是肾癌的主要病理类型，其发病机制与VHL（von Hippel-Lindau）抑癌基因的突变相关^[19]。一旦VHL基因发生突变，即便在正常非缺氧生理状态下，其编码的氨基酸蛋白（pVHL）会导致缺氧诱导因子-α（hypoxia-inducible factors-α，HIF-α）的异常激活^[20]；HIF-α随后激活VEGF与PDGF-β等缺氧诱导生长因子，从而参与肿瘤组织的新生血管生成^{[21, 22]}。此外，大多数的肾癌具EGFR表达，且表达程度与预后相关^[23]。HIF-α通过激活TGF-α产生自体分泌作用来与EGFR结合，从而促进细胞增殖与生存^[24]。无论何种生长因子与其受体的结合，通常均需通过Raf/MEK/ERK通路发挥作用；因此，索拉非尼作为多靶点的抑制剂，有可能发挥很强的靶向治疗作用。

    在评价其安全性的Ⅰ期临床试验的中，索拉非尼显示出对转移性肾癌具良好的肿瘤抑制作用。在随后的一项Ⅱ期临床随机终止试验（randomized discontinuation trial, RDT）中，202例转移性肾癌患者接受了索拉非尼的治疗（400mg，每天2次，连续口服）^[25]。经过12周的治疗以后，4%与32%的患者分别获肿瘤部分缓解（partial response）或些微缓解（minor response）；65例病情稳定（指病灶退缩或者增大不足25%）者随后被随机分组继续接受索拉非尼治疗或服用安慰剂。结果显示，继续治疗组的中位无疾病进展存活期（progression-free survival, PFS）明显高于安慰剂组（24周vs. 6周，P=0.0087）；该试验中所有持续接受索拉非尼治疗者的中位PFS为40周。有趣的是，患者的PFS与肿瘤退缩程度无关，此特异现象似乎提示索拉非尼的疗效不应以传统的肿瘤缓解标准来衡量。该试验中索拉非尼导致的常见的毒副反应包括疲乏（73%）、皮疹/脱皮（66%）、手足综合症（62%）及腹泻（58%），31%的患者出现Ⅲ度高血压。试验中未出现治疗相关死亡。

    在2005年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年会上，Escudier等^[26]报道了一项大样本Ⅲ期随机对照试验的初步结果。该试验采用索拉非尼（剂量同前）或安慰剂随机治疗了903例经免疫治疗失败的转移性肾癌患者，接受安慰剂者一旦出现疾病进展可转用索拉非尼行解救治疗。结果显示，虽然索拉非尼组的肿瘤缓解率仅为2%，但78%的患者疾病稳定；治疗组的中位肿瘤无进展存活期显著高于安慰剂组（24周vs. 12周，P< 0.00001）。除了Ⅲ/Ⅳ度手足综合症（5%）外，其他严重毒副作用的发生率均小于3%。Eisen^[27]等在2006年ASCO年会上对上述试验中患者生存的相关数据进行了后续报道。在排除了安慰剂组中因肿瘤进展而改为接受索拉非尼解救治疗者后发现，索拉非尼显著延长了患者的中位生存期（19.3个月vs. 14.3个月，P=0.01）。

    与此同时，Rya等^[28]在2006年的ASCO年会上公布了美国西南肿瘤治疗协作组（Southwest Oncology Group）的SWOG 0412试验初步结果。该项Ⅱ期临床试验针对初治的转移性肾癌患者，给予了索拉非尼联合干扰素（Interferon, IFN）（剂量：10×10⁹ IU，每周3次，皮下注射）治疗。结果显示, 根据RECIST肿瘤缓解标准，18%的患者获部分缓解，2%（1例）获完全缓解；中位无疾病进展存活期达6.5个月，似乎略好于上述试验的结果。

汇总现有资料后可发现，尽管索拉非尼治疗转移性肾癌的肿瘤缓解率较低，但其作用在于抑制肿瘤生长，从而显著延长患者的生存期。基于索拉非尼的这一特点，美国FDA于2005年12月批准转移性肾癌列为索拉非尼的治疗适应证。

2.2  索拉非尼治疗肝细胞癌   

　　　近来通过对肝细胞癌的相关分子机制的研究后发现，肝细胞癌除了普遍存在VEGF的高表达外，C-Raf与其发生发展有着密切的联系^[29]：首先，Ras作为C-Raf的上游基因在30%的肝细胞癌中存在突变^[30]；其次，一项针对肝细胞癌活检的研究显示，100%具C-Raf基因过度表达，50%具C-Raf激活上调^[31]；此外，C-Raf下游基因MEK的过度表达可抑制细胞凋亡，从而导致肝癌细胞的过度增殖^[32]。

在一项Ⅰ期临床研究中，一位转移性肝细胞癌患者在接受索拉非尼治疗后获部分缓解^[33]。近期报道的一项较大规模的国际多中心Ⅱ期临床试验^[34]采用索拉非尼单药（剂量：400mg，每天2次，连续口服）治疗了137例无法手术切除的进展期肝细胞癌患者，入组患者的中位年龄为69岁，总体健康状况（ECOG PS）评分均为0~1。该试验结果显示：经过独立评判结构的评价， 2.2%与5.8%的患者经治疗后分别获部分或微小缓解；33.6%获至少为期16周的疾病稳定；患者的中位无疾病进展时间（time to progression, TTP）与总生存期分别为4.2与9.2个月；Ⅲ/Ⅳ度毒副反应主要包括疲倦（9.5%）、腹泻（8.0%）与手足综合症（5.1%）。该试验结果同时发现，治疗前具有高水平肿瘤pERK者的无疾病进展时间较长，提示pERK可能是一个有效的生物标志物。相比以往针对肝细胞癌的细胞毒药物试验，该项Ⅱ期试验的生存结果具可比性；虽然患者入组可能存在选择性偏倚，但该试验的大样本量增加了试验结果的可靠性。

    迄今，针对无法手术切除的肝细胞癌并无标准的治疗方案。尽管包括单药阿霉素以及PIAF（顺铂、干扰素、阿霉素与5-Fu）在内的化疗具一定的疗效，但治疗耐受性很差。上述Ⅱ期临床试验结果虽未显示索拉非尼单药治疗对提高肿瘤缓解率具明显疗效，但其在患者无疾病进展生存与总生存期方面的疗效近似于化疗结果，且患者耐受良好，可称为一大进步。基于现有资料，索拉非尼与细胞毒药物联合治疗无法切除的晚期肝细胞癌的临床试验正在开展之中。

2.3  索拉非尼治疗恶性黑色素瘤   

　　　对于恶性黑色素瘤的基础研究发现，B-Raf的突变在肿瘤细胞中较为普遍。一项体外研究显示，80%的恶性黑色素瘤细胞株存在B-Raf的突变^[35]。而且，通过ERK介导的小眼畸形转录因子（microthalmia transcription factor, MITF）磷酸化，B-Raf的突变不但与黑色素瘤细胞的恶变有关，还直接提示预后不良^{[36, 37]}。此外，一项免疫组化的研究发现，与正常黑色素细胞或良性痣相比，恶性黑色素瘤组织中具有高表达的磷酸化ERK（pERK）^[38]。种种迹象表明，B-Raf/MEK/ERK通路很可能参与了恶性黑色素瘤的发生、发展及转移。

　　　在索拉非尼单药治疗转移性黑色素瘤的研究中，初期的一项小规模Ⅱ期临床试验的结果未能证明其疗效^[39]。20例入组患者接受了12周的索拉非尼（400mg，每天2次，连续口服）治疗后，仅1例获肿瘤部分缓解，3例疾病稳定。尽管该试验并未对B-Raf的突变情况加以检测，但初步结果已显示单纯抑制B-Raf对于控制恶性黑色素瘤是远远不够的。

　　　然而，Flaherty等^[40]报道的一项试验，采用了索拉非尼（剂量同前）与细胞毒药物（紫杉醇：225mg/m²，卡铂：AUC 6，每3周重复）联合应用的治疗策略。该试验在治疗了32例转移性恶性黑色素瘤患者后发现，肿瘤缓解率与疾病稳定率分别达34%与59%，但未报道生存结果。有趣的是，通过对肿瘤B-Raf突变的检测显示，肿瘤缓解率与B-Raf的状态不存在相关性。

2006年的ASCO年会上报道的两项索拉非尼联合细胞毒药物治疗恶性黑色素瘤的Ⅱ期临床试验结果同样显示了联合治疗的疗效。Lorigan等^[41]发表的报道显示，经索拉非尼联合氮烯咪胺（1000mg/m²，每3周重复）治疗后的肿瘤缓解率达13%，患者的中位无疾病进展生存期与总生存期分别为3.7与9.3个月。Amaravadi等^[42]报道的一项试验中，患者随机接受了两种剂量的替莫唑胺（A组：75mg//m²/天，连续口服6周，每8周重复；B组：150mg//m²/天，连续口服5天，每4周重复）。结果显示，两组患者的肿瘤缓解率分别为39%与21%，但中位无疾病进展生存期相似（6.2个月vs. 5.8个月）。

综上所述，虽然B-Raf在理论上是恶性黑色素瘤的一个理想的治疗靶点，但索拉非尼单药治疗的疗效一般。尽管上述试验均为初步报道，索拉非尼与细胞毒药物联合应用的协同作用已逐渐显现。然而，目前并不明确B-Raf激酶对治疗是否存在作用。索拉非尼可能通过抑制VEGFR和PDGF-β提高了恶性黑色素瘤对化疗的敏感性。上述设想皆有待进一步研究的证实，恶性黑色素瘤的最佳联合治疗模式与方案也需Ⅲ期临床试验的验证。

2.4  索拉非尼治疗非小细胞肺癌   

　　　靶向治疗是近年来非小细胞肺癌治疗的研究热点。多种靶向治疗药物，尤其是酪氨酸激酶抑制剂（如吉非替尼等）单药已被广泛应用于晚期非小细胞肺癌的治疗，其疗效已获多项随机临床试验结果证实。旨在研究索拉非尼对非小细胞肺癌治疗疗效的临床试验目前已初步展开。Gatzemeier等^[43]于近期报道的一项多中心Ⅱ期临床试验以索拉非尼单药治疗了54例复发或难治性非小细胞肺癌。虽然入组患者接受治疗后无一例获部分缓解，但29%的病例出现微缓解（包括4例肿瘤体积缩小越30%），且高达59%的患者疾病稳定；入组患者中51例可随访者的中位肿瘤无进展存活期与总存活期分别为11.9与29.3周。

鉴于索拉非尼与细胞毒药物间可能存在的协同作用，加上Raf激酶及其介导的Raf/MEK/ERK通路与许多生长因子包括EGFR、VEGF及血小板衍生生长因子（PDGF）等密切相关，目前展开的临床试验多采用多药联合治疗方案。美国东部肿瘤治疗协作组（Eastern Collaborative Oncology Group）^[44]完成的一项以索拉非尼联合卡铂与紫杉醇治疗15例进展性非小细胞肺癌的Ⅰ期临床试验结果表明，该治疗方案可耐受。另一项研究索拉非尼与吉非替尼联合应用的多靶点治疗晚期非小细胞肺癌Ⅰ期临床试验的初步结果同样显示，同期接受两种靶向治疗药物可耐受，且入组的12例复发或难治性非小细胞肺癌病例中9例病情稳定或部分缓解^[45]。另外，旨在比较紫杉醇单药与紫杉醇联合索拉非尼治疗晚期非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验，以及研究索拉非尼与贝伐单抗联合治疗安全性的Ⅰ期临床试验也正在积极筹备当中。

3  总结与展望

尽管目前对于Raf激酶及其相关通路的作用已取得了一定的认识，但因对其作用的具体机制仍不甚明朗，直接制约了Raf激酶抑制剂的合理应用及新药开发。索拉非尼作为第一个Raf激酶抑制剂，已在多种肿瘤尤其是肾癌的治疗上显示出一定的疗效，并被批准用于晚期肾癌的治疗。然而，索拉非尼在一系列临床试验中显现的对肿瘤细胞的作用模式，即在疾病稳定而未达肿瘤缓解情况下使患者的无疾病进展存活期得以延长，对抗肿瘤药物研发的意义可能更为深远。

    索拉非尼的最佳应用模式及对其他肿瘤的疗效仍需大量临床试验的进一步研究。对Raf激酶抑制剂的下一步的研究将主要针对 Raf/MEK/ERK通路与Ras突变、新生血管形成、抗细胞凋亡等肿瘤生存机制间的具体联系以及针对不同类型肿瘤疗效的个体化展开研究。随着现代制药技术的发展，针对Raf、VEGF、EGFR以及mTOR（mammalian target of rapamycin）等靶点的多靶点药物将被不断研发，从而从各个层面起到抑制肿瘤的作用。

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